Isang Vial, Dalawang Target: Portable CRISPR-Based Tuberculosis Diagnosis na may 100% Sensitivity

Ang isang papel tungkol sa isang portable tuberculosis test na maaaring gawin nang direkta mula sa plema, nang walang kumplikadong kagamitan, ay inilathala sa Science Advances. Ang Isothermal DNA amplification at CRISPR reading ay pinagsama sa iisang test tube; dalawang konserbatibong M. tuberculosis insertion (IS6110 at IS1081) ang sinusuri nang sabay-sabay, kasama ang isang gene ng tao bilang internal sample control. Sa isang maliit na "bulag" na pagsubok sa mga klinikal na sample, ang pagsubok ay nagbigay ng 100% sensitivity (6/6) at 100% na pagtitiyak (7/7) kumpara sa kultura; ang limitasyon sa pagtuklas ay ~69–81 CFU/ml sa kunwa na plema. Ang resulta ay makikita sa papel na test strip, at ang mga reagents ay lyophilized (imbak na walang "cold chain").

Background

Ayon sa WHO, ang TB ay papatay ng humigit-kumulang 1.25 milyong tao sa 2023; Ang TB ay muling naging nangungunang sanhi ng kamatayan, na may tinatayang 10.8 milyong kaso. Ginagawa nitong kritikal ang naa-access at mabilis na mga diagnostic, lalo na sa mga setting na limitado sa mapagkukunan.

• Ang mga kasalukuyang pagsubok ay isang kompromiso sa pagitan ng katumpakan, bilis, at presyo. Ang kulturang "pamantayan ng ginto" ay napakatumpak ngunit mabagal; ang mikroskopya ay mabilis ngunit hindi sensitibo; Ang mga PCR platform tulad ng Xpert MTB/RIF Ultra ay mas sensitibo (LOD ≈ 15.6 CFU/ml), ngunit nangangailangan ng mamahaling kagamitan at cartridge, na naglilimita sa saklaw.
• Bakit isothermal at CRISPR. Gumagana ang Isothermal RPA amplification sa 37–42 °C at hindi nangangailangan ng mga thermal cyclers — maginhawa “sa field”. Ang pagbabasa ng CRISPR (Cas12/13) ay nagdaragdag ng pagtitiyak ng mga species at nagbibigay-daan sa visual lateral flow (“strip”) nang walang kumplikadong optika. Sa kabuuan, ito ang daan patungo sa portable at murang PVR test.
• Bakit dalawang MBT ang nagta-target nang sabay-sabay (IS6110 + IS1081). Ang IS6110 ay isang multicopy na insert ng M. tuberculosis complex, ngunit ang ilang mga linya ay may kaunting mga kopya, at ang mga pagsubok para sa IS6110 lamang ay maaaring "makaligtaan." Ang pagdaragdag ng pangalawang IS1081 insert ay nakakabawas sa panganib ng mga false-negative na resulta.
• Bakit panloob na kontrol ng tao. Ang mga sample ng hininga ay maaaring maglaman ng mga inhibitor at "masamang" sample. Ang endogenous na kontrol ng tao (hal. RNase P/genomic DNA) ay nagpapatunay na ang materyal ay sapat at ang reaksyon ay hindi pinipigilan - kung hindi, ang resulta ay hindi maituturing na negatibo.
• Ang one-pot na format ay mahalaga sa sarili nito. Binabawasan nito ang mga hakbang, binabawasan ang panganib ng kontaminasyon, at pinapadali ang trabaho sa labas ng lab. Ang ganitong mga diskarte para sa TB ay nagpakita na ng posibilidad; pinalawak ng bagong gawain ang ideya sa isang dual-target na format na may mga panloob na kontrol, at nagpapakita ng lyophilization ng mga reagents at isang strip reader.
• Ano ang halaga ng kasalukuyang artikulo? Direktang ipinakita ng mga may-akda ang pagtuklas mula sa sputum pagkatapos ng pinaka-pinasimpleng paghahanda ng sample, ang limitasyon sa pagtuklas sa ~70–80 CFU/ml sa simulate na sputum, at 100% sensitivity/specificity sa isang maliit na blind set ng mga klinikal na sample — isang magandang "tech demo" para sa karagdagang pagpapatunay ng multicenter.

Paano ito gumagana

• Pinagsama ng mga siyentipiko ang RPA (mabilis na isothermal amplification ng genetic material sa 37 °C) kasama ang "cutting" enzymes na Cas13a/Cas12a. Ang pagkakaroon ng napiling gabay na mga RNA, na-configure nila ang system upang i-target ang dalawang target ng MBT nang sabay-sabay, at kahanay sa DNA ng tao (pagsusuri na mayroong materyal sa sample at ang reaksyon ay hindi "natigil").
• Ang lahat ng kimika ay napupunta sa isang test tube; pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog, ang resulta ay binabasa alinman sa isang fluorimeter o sa isang lateral flow strip - mahalagang tulad ng isang express test.
• Ang pagpoproseso ng plema ay pinasimple sa pag-init at isang maikling centrifuge—nang walang mga extractor ng nucleic acid. Para sa pinakalimitadong kundisyon, tinatalakay pa ng mga may-akda ang mga manu-manong alternatibo sa centrifuge.

Ano ang ipinakita ng mga pagsubok

• Limitasyon sa pagtuklas: 69.0 CFU/ml (strain H37Rv) at 80.5 CFU/ml (BCG) sa "spike" sputum. Walang nakitang cross-reactivity sa ibang bacteria/fungi.
• Clinical setting (blinded sample): sa 13 sample mula sa totoong kasanayan - 100% sensitivity (6/6) at 100% specificity (7/7) kaugnay ng seeding. Para sa paghahambing, sa parehong kit ang GeneXpert Ultra ay nagpakita ng 100%/86%, ayon sa pagkakabanggit.
• Mga teknikal na nuances: sa dalawang pagpipilian sa pagbabasa, ang Cas13a ay gumana nang mas mahusay (para sa "one-pot" na format, ito ay mas sensitibo kaysa sa Cas12a). Dagdag pa, ang parallel testing ng dalawang Mtb target ay binabawasan ang panganib ng mga maling resulta.

Bakit kailangan ito?

Ang mga pagsusulit ngayon ay isang kompromiso sa pagitan ng katumpakan, bilis, at kakayahang magamit: ang kultura ay napakatumpak ngunit mabagal; ang mga pamunas ay mabilis ngunit hindi tumpak; Ang mga PCR system tulad ng GeneXpert ay tumpak at mabilis ngunit nangangailangan ng mga mamahaling instrumento at cartridge. Ang bagong diskarte sa CRISPR ay naglalayong isara ang agwat: mga diagnostic sa field na gumagana sa 37°C, na may mga pagbabasa ng strip ng papel, at ang potensyal na mag-imbak ng mga reagents nang walang pagpapalamig.

Mga limitasyon at kung ano ang susunod

Ito ay isang maagang demonstrasyon sa isang maliit na klinikal na set - malaki, multi-center na mga pagsusuri ay kailangan (kabilang ang HIV coinfection, sa mga bata, na may paucibacillary form at iba't ibang mga linya ng MBT). Ang mga may-akda ay hiwalay na tandaan na sa "field" na bersyon mismo, ang tabletop centrifuge ay kailangang mapalitan ng isang ganap na manu-manong solusyon. Ngunit ang mismong arkitektura - "dalawang target + internal control" sa isang test tube - ay napatunayan na ang operability nito at nagbibigay ng isang malinaw na landas sa refinement para sa mass use.

Pinagmulan: Alexandra G. Bell et al. Isang naka-streamline na pagsubok na batay sa CRISPR para sa pagtuklas ng tuberculosis nang direkta mula sa sputum, Science Advances, online noong Agosto 6, 2025 (Vol. 11, Isyu 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206